Cleavage Under Target & Release Using Nuclease (CUT&RUN) to nowa technologia umożliwiająca badanie interakcji białko-DNA.
Doskonała alternatywa dla ChIP.
Zalety metody
• Oszczędność materiału – potrzebne tylko 100 000 komórek.
• Oszczędność czasu – cała procedura zajmuje tylko 1–2 dni.
• Uniwersalność – badanymi białkami mogą być podjednostki histonowe, czynniki transkrypcyjne i inne białka oddziałujące z chromatyną.
• Powtarzalność
• Wygoda – brak immunoprecypitacji i konieczności utrwalania białek z DNA przy użyciu formaldehydu.
Dowiedz się więcej …
Metoda działania:
CUT&RUN to metoda in vivo, która wykorzystuje specyficzne przeciwciała rozpoznające badane białko oraz Protein A-Protein-G-Micrococcal Nuclease (pAG-MNase) do izolowania specyficznych kompleksów białko-DNA. Cała procedura zajmuje tylko 1–2 dni i można ją zautomatyzować w celu uzyskania maksymalnej przepustowości i powtarzalności.
1. Aby wyizolować interesujący kompleks białko-DNA, komórki są najpierw zbierane i łączone z kulkami magnetycznymi powleczonymi Concanavalin A (minimalizuje to utratę komórek w trakcie koleknych płukań).
2. Błony komórkowe są permeabilizowane przy użyciu digitoniyza, aby ułatwić wejście przeciwciała pierwszorzędowego oraz pAG-MNase do jąder komórkowych.
3. Przeciwciała pierwszorzędowe wiąże się poprzez łańcuch ciężki z domeną pAG białka fuzyjnego pAG-MNase. Kompleks przeciwciało-pAG-MNase kieruje się do interesującego regionu chromatyny, gdzie przeciwciało wiąże się z histonem, czynnikiem transkrypcyjnym lub kofaktorem będącym przedmiotem zainteresowania.
4. Dodanie Ca2 + aktywuje pAG-MNazę i inicjuje trawienia DNA. Pozwala to na rozszczepienie i uwolnienie fragmentu chromatyny, który następnie dyfunduje z dala od reszty chromatyny genomowej, a następnie z jąder komórkowych, do supernatantu.
5. Z supernatantu DNA izoluje się za pomocą kolumn do oczyszczania DNA lub ekstrakcji fenolem/chloroformem, a następnie strącania etanolem.
6. Oczyszczone i wzbogacone DNA może następnie być wykorzystane do qPCR lub użyte do przygotowania biblioteki do sekwencjonowania (NGS).
CUT&RUN FAQ’s – Najczęściej zadawane pytania.
Dostępne produkty:
• CUT&RUN Assay Kit #86652
• CUT&RUN pAG-MNase and Spike-In DNA #40366
Lista wszystkich przeciwciał i odczynników przeznaczonych do metody CUT&RUN.